1、氧化應(yīng)激與病毒感染。
氧化應(yīng)激(OS)是指機(jī)體受到有害刺激時(shí)，比如病毒感染等，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的高活性分子，如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)，使體內(nèi)氧化程度超出氧化物的清除能力，呈現(xiàn)促氧化狀態(tài)，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，引起組織和細(xì)胞的損傷。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，能對(duì)機(jī)體幾乎所有的組織器官造成傷害，進(jìn)而誘發(fā)發(fā)生疾病及衰老效應(yīng)。除氧化應(yīng)激外，機(jī)體還存在還原應(yīng)激的情況，如缺氧狀態(tài)下，一些酶類(lèi)能產(chǎn)生大量的還原劑，導(dǎo)致氧過(guò)度還原，形成超氧陰離子基團(tuán)(O2·－)，同樣能對(duì)機(jī)體造成損傷。
病毒感染是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生的直接原因，并與氧化損傷程度密切相關(guān)。一方面，病毒感染引起ROS釋放；另一面，感染使呑噬細(xì)胞活化并釋放前氧化性細(xì)胞因子，如TNF和IL-1。ROS引起細(xì)胞膜磷脂層的脂質(zhì)過(guò)氧化，這一過(guò)程生成的產(chǎn)物可以跨越細(xì)胞膜并引起膜轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體呼吸鏈的功能紊亂。因此，ROS通常被視為病毒性病理進(jìn)程中引起細(xì)胞損傷的元兇。
另一方面，ROS在病毒性病理進(jìn)程中也能激活機(jī)體兔疫系統(tǒng)，在病毒清除和免疫導(dǎo)致的細(xì)胞損傷方面起到正面的調(diào)節(jié)作用?？寡趸瘎┖涂乖岢始?xì)胞一起孵育能抑制T細(xì)胞增殖，從而減少免疫導(dǎo)致的組織損傷。抗氧化劑還抑制抗原刺激引起的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的活化，從而抑制細(xì)胞增殖所必需的底物——聚胺的合成。
機(jī)體通過(guò)維持氧化物/抗氧化物平衡來(lái)保持正常狀態(tài)，而病毒通過(guò)改變宿主細(xì)胞內(nèi)前氧化物/抗氧化物的平衡，影響細(xì)胞凋亡過(guò)程。從而引起機(jī)體狀態(tài)的改變。受清除過(guò)氧化物的抗氧化劑的影響，如N—乙酰半胱氨酸、谷光甘肽過(guò)氧化物酶( GSH-Px),包括一部分病毒能產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，病毒還可通過(guò)增加細(xì)胞的前氧化物(如NO)，以及抑制抗氧化酶的合成來(lái)影響宿主的前氧化物/抗氧化物平衡。
2、自由基造成細(xì)胞病變的發(fā)生機(jī)制。
(1)何謂自由基？所謂自由基亦稱(chēng)游離基，是指能夠獨(dú)立存在的具有一個(gè)或多個(gè)不配對(duì)電子的任何元素的原子、原子團(tuán)或者是分子。它具有很高的化學(xué)活性。在生物體內(nèi)最重要的是活性氧類(lèi)(如 O2·－)和羥自由基(OH·)，尤其是超氧陰離子( O2·－)自由基。正常情況下，機(jī)體自由基的生成量很少，壽命也短，對(duì)機(jī)體不構(gòu)成危害。但是，在某些病理情況下，比如病毒感染等，自由基產(chǎn)生過(guò)多，機(jī)體不能及時(shí)清理，自由基就會(huì)損害生物膜脂質(zhì)的氧化反應(yīng)，導(dǎo)致生物膜的流動(dòng)性發(fā)生改變，膜的通透性升高，滲透壓改變，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)失衡，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生病變，動(dòng)物機(jī)體表現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)。另外，自由基可引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)、聚合和肽鏈的斷裂，也可使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合形成聚合物，從而使蛋白質(zhì)功能喪失。自由基還可作用于DNA，引起基因突變、染色體畸變和斷裂。
自由基實(shí)質(zhì)上是具有共價(jià)鍵的有機(jī)分子(RX)發(fā)生均裂后的產(chǎn)物，所謂均裂是指有機(jī)分子的共價(jià)鍵斷裂后，共用的電子對(duì)分別屬于兩個(gè)原子或原子團(tuán)，即生成含有奇數(shù)電子的自由基。如水在電離輻射下分解,可產(chǎn)生氫自由基(H·)及羥自由基(OH·)：HOH——→H·＋OH·
含有弱鍵的化合物可通過(guò)熱解、光解(電磁輻射或粒子轟擊)、氧化還原法和加氫或奪氫等途經(jīng)形成自由基。根據(jù)其組成，自由基可分為ROS和RNS等二大類(lèi)型。
(一) 活性氧自由基(ROS)。主要是超氧陰離子自由基(O2·－)。由三線態(tài)的氧分子(3O2)單電子還原生成。生成過(guò)程受一些重要物質(zhì)的調(diào)節(jié)，其中有酶類(lèi)物質(zhì)，如NAD(P)H氧化酶和黃嘌呤脫氫酶；或者非酶類(lèi)的還原反應(yīng)產(chǎn)物，如線粒體電子傳遞鏈中的半一泛醌化合物。機(jī)體內(nèi)的O2·－可經(jīng)超氧化物歧化酶(SOD)催化生成非自由性質(zhì)的過(guò)氧化氫(H2O2)，也可經(jīng)非酶轉(zhuǎn)化生成和單線態(tài)氧(1O2)。在過(guò)渡金屬(如亞鐵或亞銅離子)的作用下，H2O2被轉(zhuǎn)化生成高反應(yīng)性的羥自由基(·OH)。另外，H2O2能被酶類(lèi)如過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)轉(zhuǎn)化生成水，從而保護(hù)細(xì)胞生物膜免遭氧化性損害。
(二) 活性氮自由基(RNS)。氮自由基(NO·)是高等生物中一氧化氮合酶( NOS)催化左旋精氨酸末端鳥(niǎo)嘌呤上的氮原子氧化而生成。在不同的環(huán)境中，NO能被催化生成多種其他的反應(yīng)氮族，包括硝基陽(yáng)離子(NO＋)、硝基陰離子(NO－)或過(guò)氧化亞硝酸鹽陰離子(ONOO－)。常見(jiàn)的自由基類(lèi)型見(jiàn)表1。

除自由基外，有些非自由基氧化物也是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的化學(xué)物質(zhì)，能引起機(jī)體氧化應(yīng)激性損傷和相關(guān)疾病的發(fā)生。非自由基氧化物對(duì)氧化應(yīng)激的發(fā)生亦有重要影響。其中，最有代表性的是過(guò)氧化氫(H2O2)。其主要來(lái)源于氧分子經(jīng)過(guò)過(guò)氧化物酶，如GSH-Px催化生成，或在線粒體內(nèi)經(jīng)SOD催化產(chǎn)生。常見(jiàn)的非自由基氧化物見(jiàn)表2。

(2)自由基的性質(zhì)與反應(yīng)特點(diǎn)。
絕大多數(shù)的自由基具有極高的化學(xué)活性。自由基尤其是溶液中產(chǎn)生的自由基，常常與相鄰的物質(zhì)迅速反應(yīng)，所以自由基的壽命極短。自由基可發(fā)生復(fù)合反應(yīng)，包括奪氫在內(nèi)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，芳香族取代反應(yīng)，氧的消耗，歧化反應(yīng)，加成反應(yīng)和連鎖反應(yīng)等。自由基反應(yīng)中最重要的是連鎖反應(yīng)。這種連鎖反應(yīng)與離子反應(yīng)不同，一經(jīng)啟動(dòng)就連鎖進(jìn)行。一般可分為引發(fā)、增殖及終止3個(gè)階段。從總體來(lái)說(shuō)，反應(yīng)起始時(shí)，引發(fā)階段占主導(dǎo)地位，反應(yīng)體系中的新生自由基形成許多鏈的開(kāi)端，反應(yīng)物濃度高。引發(fā)后的增殖階段成為反應(yīng)的主體，待到一定階段，體系中的反應(yīng)物濃度越來(lái)越少，自由基本身互相碰頭的機(jī)會(huì)越來(lái)越多，于是進(jìn)入終止階段。另外在自由基連鎖反應(yīng)中加入少量清除劑，就可以使反應(yīng)受到抑制或使之減慢。這是用自由基清除劑治療自由基性疾病的理論基礎(chǔ)。自由基連鎖反應(yīng)的最好例子是脂類(lèi)過(guò)氧化作用。生物膜中含有多種不飽和脂肪酸，在有自由基引發(fā)劑和氧的存在下，被奪走氫形成不飽和脂肪酸自由基(R·)，后者與基態(tài)穩(wěn)定的氧結(jié)合，產(chǎn)生不飽和脂肪酸過(guò)氧自由基(ROO·)，該自由基進(jìn)步攻擊另一個(gè)甲烯基團(tuán)，產(chǎn)生不飽和氫過(guò)氧化物(ROOH)和新的R·?？梢?jiàn)只要少數(shù)幾個(gè)自由基引發(fā)劑就可導(dǎo)致數(shù)以千計(jì)的分子發(fā)生自由基的反應(yīng)。丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，被稱(chēng)為生物體內(nèi)自由基的指示物，廣泛地作為各種氧自由基損傷機(jī)體的指標(biāo)。
3、自由基的來(lái)源與代謝。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，自由基產(chǎn)生的部位主要在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的線粒體。
第一、活性氧自由基(ROS)的來(lái)源與代謝。
(1)來(lái)源。機(jī)體內(nèi)，ROS主要在細(xì)胞內(nèi)的線粒體產(chǎn)生。ROS最具代表性的是超氧陰離子(O2·－)。正常情況下，O2在線粒體有氧呼吸過(guò)程中得到4個(gè)電子，被還原生成水。但依然有少量的O2被單電子還原生成O2·－。
(2)代謝。O2·－能在線粒體內(nèi)被SOD催化生成穩(wěn)定的H2O2，H2O2能被線粒體中的酶類(lèi)清除，如GSH-Px及硫氧還原蛋白氧化酶/硫氧化蛋白還原酶系統(tǒng)等。H2O2能透過(guò)線粒體酶，擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，然后被細(xì)胞質(zhì)中的抗氧化系統(tǒng)清除。線粒體所產(chǎn)生的H2O2還能作為信號(hào)分子，影響細(xì)胞質(zhì)中多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，如控制細(xì)胞周期，應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、氧化還原平衡，以及激活線粒體解偶聯(lián)反應(yīng)等。此外，還原型尼克酰胺腺嘌呤二核什酸( NADPH)能夠還原線粒體中的硫氧還原蛋白和谷胱甘肽，對(duì)清除H2O2亦很重要，因此細(xì)胞中NADPH的水平與線粒體抗氧化能力緊密相關(guān)。
在線粒體內(nèi)，部分H2O2還能被NADH/NADP脫氫酶還原。NADH/NADP轉(zhuǎn)氫酶具
有質(zhì)子泵的作用，能利用有氧呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的H＋還原NADP＋，生成 NADPH。這一過(guò)程將線粒體耦合和線粒體膜電勢(shì)能聯(lián)系起來(lái)。因此，如果線粒體缺乏充分耦合或線粒體膜電勢(shì)能下降，轉(zhuǎn)氫酶將無(wú)法產(chǎn)生 NADPH，導(dǎo)致H2O2清除率降低而出現(xiàn)氧化損傷。
線粒體中的NADP＋池也能被異檸檬酸脫氫酶還原。在低密度脂蛋白受體(LDL-R)敲除的高膽固醇血癥小鼠中，添加異檸檬酸鹽能夠糾正線粒體氧化還原反應(yīng)失衡，降低H2O2的水平。如H2O2未被線粒體中的抗氧化系統(tǒng)還原，將通過(guò)金屬催化反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH)?！H具有高度的反應(yīng)活性，通常被認(rèn)為是一種重要的損害分子。當(dāng)線粒體內(nèi)具備和成熟而有效的H2O2清除系統(tǒng)，同時(shí)存在金屬螯合機(jī)制時(shí)，能防止這種自由基的形成。使用鐵鰲合劑能預(yù)防ROS生成過(guò)度導(dǎo)致的線粒體損傷和滲透性增加。

第二、活性氮自由基(RNS)的來(lái)源與代謝。
(1)來(lái)源。RNS具有代表性的是一氧化氮自由基(NO·)，也主要來(lái)源于線粒體。通過(guò)NOS類(lèi)催化形成，該類(lèi)酶包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)一氧化氮合(iNOS)三種類(lèi)型。這些酶以左旋精氨酸( L-arginine)為底物， NADPH為電子來(lái)源，在Ca2＋和還原型硫醇的催化下生成NO·。NO·亦是生物系統(tǒng)中公認(rèn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在線粒體中具有很多已知的底物，包括亞鐵血紅素和巰基。
(2)代謝。線粒體內(nèi)存在蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，成為NO·攻擊目標(biāo)。電子傳遞鏈中的亞鐵血紅素和金屬酶類(lèi)能被NO·亞硝基化。NO·能可逆地亞硝基化細(xì)胞色素氧化酶C，調(diào)節(jié)呼吸鏈電子傳遞過(guò)程。高濃度的NO·還能夠亞硝基化含氧、氮或硫的氨基酸側(cè)鏈，改變其功能，參與缺血過(guò)程的保護(hù)作用。此外，NO·與O2·－反應(yīng)生成高活性過(guò)氧化亞硝酸鹽(ONOO－)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化和亞硝基化。在線粒體內(nèi)，ONOO－聚集能促進(jìn)線粒體蛋白質(zhì)和脂類(lèi)廣泛修飾，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜滲透性增加和功能障礙。
4、生物體內(nèi)重要的自由基及對(duì)細(xì)胞毒性損傷效應(yīng)。
在生物體內(nèi)多種物質(zhì)均可產(chǎn)生自由基，研究得最多、作用最廣泛的是氧所產(chǎn)生的自由基，它們無(wú)論在機(jī)體的正常代謝還是病理變化中均極為重要。氧的毒性是由于氧分子還原成水時(shí)產(chǎn)生的許多中間產(chǎn)物造成的，在這些產(chǎn)物中，有些產(chǎn)物不是自由基而是分子，因此統(tǒng)稱(chēng)為活性氧。它們包括：超氧陰離子自由基( O2·－)、羥基自由基( OH·)、過(guò)氧化氫( H2O2)、氫過(guò)氧基(HO2·)、烷氧基( RO·)、烷過(guò)氧基( ROO·)、氫過(guò)氧化物(ROOH)和單線態(tài)氧(1O2)。從O2還原成H2O的過(guò)程是一個(gè)一個(gè)接受電子的過(guò)程:
O2+e—→O2·-
2H＋
O2·-＋e－－—→H2O2
H＋
H2O2+e－—→OH·＋H2O
H＋
OH·+e－-→H2O
據(jù)研究，機(jī)體細(xì)胞在正常代謝過(guò)程中，或者是受到某些物理的、化學(xué)的和生物的應(yīng)激因素作用時(shí)，就產(chǎn)生活性氧(O2·－)等自由基。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基可作為信號(hào)分子，參與體內(nèi)防御反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)。但是在病理?xiàng)l件下，生物體內(nèi)過(guò)多的自由基就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒損傷效應(yīng)，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。
(1)直接引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；
(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性，使蛋白質(zhì)功能喪失和酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，組織損傷；
(3)破壞核酸和染色體，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂、染色體畸變或斷裂；
(4)血管壁處的氧化應(yīng)激引起低密度脂蛋白(LDL)氧化修飾，氧化型低密度脂蛋白( Ox-LDL)不能被LDL受體識(shí)別、代謝，而被單核巨噬細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜上的清道夫受體攝取，形成泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)斑塊；
(5)破壞細(xì)胞外基質(zhì)，使其變疏松，彈性降低；
(6)O2和H2O2可刺激核因子-kB(NF-kB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，導(dǎo)致血
管平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖；
(7)ONOO－通過(guò)影響細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和離子通道使蛋白質(zhì)發(fā)生硝基化或失活
再限制線粒體呼吸，引起細(xì)胞凋亡。
在活性氧中，OH·是最活潑的自由基，其反應(yīng)可分成奪氫、加成和電子轉(zhuǎn)移3類(lèi)，可作用于糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等有機(jī)物大分子，生成活潑性各異的次級(jí)自由基。例如可與碳酸離子反應(yīng)生成碳酸自由基(CO3－·)，后者是強(qiáng)氧化劑。O2－的毒性作用不是其本身引起的，而是O2－與H2O2相互作用后形成的OH·引起的(H2O2+O2——O2+OH－-+OH·)。H2O2是弱氧化劑，可使少數(shù)酶的-SH基氧化而失活。H2O2能迅速穿過(guò)細(xì)胞膜，而O2·－不能。在細(xì)胞內(nèi)側(cè)的H2O2能與Fe2＋或Cu2＋生成OH·。研究還證明，上述三種活性氧能引起DNA損傷。因此，活性氧過(guò)多顯然對(duì)機(jī)體不利，會(huì)對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞造成一定程度損害。以上則是動(dòng)物機(jī)體受物理、化學(xué)或者生物感染等應(yīng)激因素作用時(shí)，各種組織細(xì)胞發(fā)生病變的重要機(jī)理。
為了維持生物體內(nèi)的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡之中，動(dòng)物機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中就產(chǎn)生能夠清除體內(nèi)的自由基一些物質(zhì)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為自由基清除劑。在正常狀態(tài)下，機(jī)體可產(chǎn)生少量自由基參與正常代謝，同時(shí)體內(nèi)存在清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的體系，使得過(guò)多的自由基被清除。但在某些病理狀態(tài)下，這一機(jī)制遭到破壞，體內(nèi)自由基顯著增加，過(guò)多的自由基可直接作用于機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體損傷和抗氧化防御能力下降。自由基清除劑可直接清除自由基，抑制自由基的生成或是激活機(jī)體抗氧化體系，預(yù)防氧化應(yīng)激傷害?？傮w上自由基清除劑可歸為兩類(lèi)，如表3所列示。
(1)酶類(lèi)清除劑。主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( GSP-Px)以及還原型谷胱甘肽(GSH)等，它們能夠輔助細(xì)胞并去除自由基，使自由基還原為惰性分子。
(2)非酶類(lèi)清除劑。一般包括黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、糖類(lèi)、B胡蘿卜素、維生素C、維生素E等及活性肽類(lèi)，這些物質(zhì)能接受額外電子而自身保持化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定。

由表3可知，體內(nèi)具有清除活性氧的酶，主要是超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等。SOD能清除O2·－，同時(shí)生成
H202。H202又可被CAT清除。而GSH-Px既可清除H202，又可清除ROO·及ROOH。其反應(yīng)式如下：
SOD
O2·－＋O2·－＋2H＋—→H2O2＋O2
CAT,GSH-Px
2H2O2—————→2H2O＋O2
GSH-Px
ROOH＋GSH————→ROH＋GSSG＋H2O
由上反應(yīng)式可見(jiàn)，體內(nèi)徹底清除活性氧，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)起到非常重要的作用。 GSH-Px是被公認(rèn)為哺乳動(dòng)物第一個(gè)含硒酶，GSH-Px廣泛存在于動(dòng)物的紅細(xì)胞、肝臟、肺、心、腎、腦及其他組織中，它能利用還原性谷胱甘肽(GSH)將有害的氫過(guò)氧化物(ROOH)和H2O2分別還原成無(wú)害的羥基脂肪酸(ROH)和水(H2O)，從而保護(hù)細(xì)胞生物膜免遭氧化性損害。
GSH-Px
2H2O2＋2GSH————→GSSG＋2H2O
GSH-Px
ROOH＋2GSH————→GSSG＋ROH＋H2O
綜上所述，病毒感染與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。機(jī)體通過(guò)維持氧化物與抗氧化物的平衡來(lái)保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而病毒感染則引起機(jī)體內(nèi)部氧化劑與抗氧化劑的平衡失調(diào)。當(dāng)機(jī)體遭受病毒感染時(shí)，體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過(guò)多，如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)，氧化程度超出氧化物的清除能力，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，從而致使組織和細(xì)胞氧化損傷。由表3可見(jiàn)，除以上酶外，自由基清除劑還有有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、糖類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、維生素E、維生素C等有機(jī)化合物成分。此部分自由基清除劑則可由中藥化學(xué)成分提供，以上即是中藥藥用植物抗病毒感染作用的重要機(jī)理。

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